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畜 类
营养诱导的影响仔猪骨骼发育的细胞信号
时间:2015/4/29 15:39:44 浏览:3218次

近年来,维生素D的缺乏使得美国养殖场的跛行发病率和死亡率上升,至于为何会突然出现该现象仍缺乏合理的解释。养殖场通过补充维D及其类似物来减少这种影响,但是问题依旧存在。虽然发病数得到控制,但这引起了研究者对骨骼成分及影响其完整性因素的研究兴趣。尸检报告中所形容的骨折、软骨硬化障碍以及“橡皮骨”,均反映了营养缺乏对骨骼的影响。我们需要更多的研究,从而可以更加明确地阐述动物所需营养和影响营养配方的环境因素之间的平衡关系。
 

  本文主要就骨骼成分、口粮营养对骨骼成分的影响以及临床和实验室量化骨骼完整性的一系列方法做一简要说明。同时,对营养成分诱导的细胞信号进行介绍,并分析其用于鉴别猪骨骼异常原因的可能性。然而,涉及到“猪体内维D和骨骼内稳定的特异细胞信号”方面的研究还未见有报道,因此本文只做推测性质的判断。在近期开展的一项研究中,实验动物的预混料意外发生了维D缺乏并引起一定的症状表现,这引起了我们研究维D和骨骼异常之间关系的兴趣。我们发现,更好地理解维D影响软骨骨化过程的信号通路,将有助于对跛行和骨骼异常引起的运动失调类型疾病的治疗研究。
 

  骨骼成分和完整性
 

  营养因素引起类似临床症状的诊断
 

  在讨论介导软骨骨化的信号通路之前,需先对关于骨骼成分和一些用于诊断骨骼问题的方法做一个总结。
 

  骨组织的成分
 

  骨组织的水分和脂肪含量因年龄、骨骼类型和营养水平而异。矿物元素的含量意味着骨骼干物质的含量,常用去脂重量来描述,因为骨有机质与矿物质结合后形成饱和脂肪。在此前提下,全骨的大约56%为矿物灰,成年母猪骨骼中的这个比例从62%到72%不等,而青年猪的从44%到46%不等。因此,要分析骨骼成分,骨骼样本及供体年龄的选择是关键因素。但是,总体来说,钙(38-40%)和磷(17-19%)的含量是恒定的,且保持2.1︰1的钙磷比,因而钙磷比常作为鉴别骨骼成分分析结果是否正确的指标。
 

  骨强度
 

  骨强度与组成骨骼的无机质和有机质均有关。成骨细胞合成的有机质分泌至细胞外基质后,首先和分散在胞外基质中的与多聚糖蛋白结合在一起的胶原纤维发生作用,形成羟基磷灰石[(Ca3(PO4)2)3·Ca(OH)2]样的矿物结晶体。机体的激素和生长因子刺激成骨细胞的增殖和分化,促进有机质的生成和聚集,但这种刺激并没有直接促进矿物结晶体的形成。营养过量将破坏平衡并降低营养的利用效率。
 

  有机质和矿物晶体的组合构成骨骼的强度。胶原纤维提供拉伸(抗拉伸)强度,矿物晶体提供抗压强度,二者的配合使得机体可以应对外界的各种外力作用。
 

  单一骨骼样本的选择
 

  取决于该骨头是否可以反映机体在该年龄段的机体特征,因为机体的骨头并非保持相同的生长速度,并且对营养成分的反映也各自不同。借助双能X射线骨密度(DXA)扫描仪可以分析骨骼对于日粮营养的反映。在青年猪(25-30 kg),股骨相对于腓骨更适应高磷的日粮,因而在骨灰中表现更高的磷含量。因此,如果选择腓骨来分析,则机体骨矿物质含量较实际是偏低的,而我们可以计算这种差异从而准确分析。同时,对于猪来说,机体所有组织均消耗吸收饲料营养,因此股骨或者腓骨应该是理想的样本选择。然而,在另一个研究中,选择40-120 kg的猪,发现不同骨头(股骨、前肢或后肢)的这种差异并没有想象中的那么明显(表1),同时针对腓骨的分析较实际是偏高的。因此,四肢骨骼不适于选作样本。
 

  表1 不同骨的矿物含量(rBMC)表示40-120kg猪机体骨矿物含量(rPBMC)的回归方程



所有值(n=78,其中40 kg、80 kg、120 kg各6头、24头、48头),按猪的最大骨矿物质含量做校准。]
 

  骨骼评估方法
 

  传统评估骨头完整性的方法主要有组织学分析、重量评估和力学分析三种(表2)。此三种方法常提供各自特定的分析结论,均有其局限性,因此需要综合分析以作出最终的判断。面对急性案例时,临床需要快速作出诊断,先采用简单快捷的方法比如视诊确定缺损的范围,之后结合骨灰成分分析结果作为前期的判断依据。慢性案例则可尝试使用市场上动物的前腿骨作为实验样本,运用DXA扫描仪来确定矿物质含量。组织学和力学分析更准确,但需要耗费更长的时间,也更昂贵。此外,骨灰成分分析也可应用于诊断那些临床上已经表现明显症状的群体。相对于临床症状,通过选取指标来诊断和定量分析显然更加理想。
 

  DXA扫描仪同样具有其限制性。首先,虽然DXA可以精确分析出骨灰矿物质元素的含量,但实际上并不能完全反映出骨的完整性。其次,关节损伤和肢体伤口也可引起跛形,而DXA扫描仪对此并不能作出识别。

  表2 评估营养成分摄入对骨组织影响的方法

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关于营养因素的推论
 

  营养不良期的恢复
 

  本文不讨论日粮中钙磷浓度对猪骨骼矿物质沉积的影响。营养不良可导致骨质疏松、四肢不调(佝偻病)以及自发性骨折。日粮中钙磷含量及钙磷比都已经固定,而磷的吸收则通过日粮中植酸酶的常规添加得以保障,关于包含植酸酶的日粮钙磷补充剂的研究仍在继续。多样化的饲料配方可能导致某些肢体问题升级,但实际上,更关键的因素在于饲料质量管理和植酸酶的稳定性。然而,大多数文章仅仅关注猪群采食的饲料是否包含有足够高的营养成分含量。
 

  近期剧增的维D相关跛行发病数量引起了大家对饲料配方中质量控制环节的关注。质量控制过程失误可导致营养流失。近期有研究报道,在经历即使较短的营养不良期后,生长猪机体也无法恢复正常的骨骼矿物含量(BMC)。一项研究表明,相对于饲喂150%钙磷含量的青年猪,饲喂70%钙磷量的猪群可在4周内出现机体骨矿物沉积量降低61.6%的症状。运用DXA扫描仪对同一动物反复监测,显示即使在随后的8个星期内给其饲喂150%钙磷量,BMC仍未能恢复至正常水平。不过股骨却可以在这8个星期的补偿期里摄入足够高的钙磷,并恢复到正常的骨骼强度。这说明,机体内矿物质元素优先供给受力起支撑作用的骨骼,并在此保存下来。
 

  这些实验结果解释了骨灰矿物质分析和力学分析之间结论的矛盾。此外,在哺乳仔猪、育肥猪及其他的研究上,也报道过两者结论之间的不符合。事实上,骨强度的合理范围区间仍未被明确界定。个别骨头的力学分析结果已经被用于描述营养供给对动物机体的影响。维持最大骨强度所需营养成分含量远高于维持骨骼最大矿物质含量。因此,骨无机质含量与骨强度无直接的比例关系。此外,实验室并没有测量骨骼力学特性的统一标准,而较长的时间耗费以及设备仪器要求也影响了力学研究在临床诊断中的应用。因此,力学研究常只在特定的科研项目中运用。
 

  弓背猪给的启示
 

  早在2008之前,驼背被认为是猪群中散发的一种先天性疾病,引起猪弓背,伴发脊髓机能障碍。虽然会给猪群带来各种不便,但人们通常认为其对整个养殖业的影响微乎其微。而在2008年的一项试验中,我们发现在一定条件下,对日粮做一定处理后,可以诱发猪驼背病的发生。这提示,骨骼和结缔组织的发育与骨头矿物质化和软骨病的发生存在某钟联系。
 

  维D直接参与调节机体钙的平衡,此外,对一种新型激素的研究让我们开始关注维D和磷与骨骼之间的相互作用。传统的维D影响钙磷平衡的方式被认为是通过甲状旁腺激素发挥作用(图1A)。血钙浓度的变化引起甲状旁腺激素活性和数量的变化,而甲状旁腺激素可使肾脏、胃肠道及骨骼等靶器官发生一系列的变化。近来的研究发现,维D可直接作用于骨细胞上的维D受体(VDR),进而通过激活细胞信号通路调节磷的平衡。这种新发现的尿磷酸盐激素为纤维原细胞生长因子23(FGF-23),由成骨细胞生成,它通过FGF-23-维D-磷反馈调节通路影响体内磷的平衡(图1B)。
 



图1 传统的通过PTH影响磷平衡和通过VDR直接作用于骨骼影响骨磷平衡的比较

 

  这个新的信号通路可以提高磷使用效率。传统的生猪日粮更为注重钙磷含量的加强,而忽视了其使用效率的问题,同时日粮中磷的运用又受到原料费用以及环保压力的影响。因此,钙磷尤其是磷的使用,在猪的日粮中受制明显。FGF-23通路的发现挑战了传统的观念。骨组织是研究FGF-23的最佳样本。据此,我们可以通过改变饲料配方,提高磷的利用效率。
 

  如上所述,越来越多的研究者关注维D调节磷代谢的机制。2008年,华盛顿大学猪教研中心(SRTC)的四月龄内猪大规模爆发驼背病(接近20%的发病率)(图2)。通过对猪群的密切监察发现,驼背猪与不驼背猪在遗传学和健康度上并无差异。通过对三个驼背高发病率猪群进行调查发现,病变损伤主要发生在第14、15和16节胸椎。作为驼背病的典型病变部位-楔形椎骨,表现出以软骨骨化障碍为特征的组织学损伤。FGF参与软骨发育过程,缺失FGF-23的小鼠,解剖发现其全身骨骼畸形,在猪身上则表现为驼背。
 



图2 30 kg一下青年猪表现驼背,一节DXA扫描仪对脊椎扫描的图片
 

  SRTC驼背病爆发后,研究者经过反复调查,最后发现是因为连续四个月使用缺乏维D3的饲料饲喂猪群,但饲料中含有边际量的钙磷含量。用问题饲料饲喂怀孕母猪群,会对它们生产的小猪产生影响,日后表现为驼背。
 

  随后他们进一步对青年猪安排实验,以确认维D与驼背的关系。给母猪饲喂不含有维D补充剂的怀孕料,观察出生小猪是否表现驼背,并给断奶猪饲喂不含维D补充剂的饲料。此外针对钙磷,一组饲喂含有足量钙磷补充剂(按98年NRC推荐需要量的120%)的饲料,一组饲喂含边际量钙磷补充剂(按98年NRC推荐需要量的80%)的饲料。结果发现,饲喂边际量补充剂的猪表现驼背,约21%的发病率,病猪表现生长迟缓,9周龄时的DXA监测结果显示骨矿物质含量也降低。而用含有补充维D(280 IU D3/kg)日粮饲喂的母猪,其生产的仔猪9周龄时无驼背病例发生,但是到13周龄时会有25%的猪发生驼背,且饲喂边际量钙磷补充剂的断奶猪亦有25%出现驼背,而未补充维D的母猪所产仔猪的发病率则提高到33%。这说明,母猪日龄中维D的浓度影响仔猪出现驼背症状的时间。
 

  根据稍早的研究,上述试验中所使用的边际日龄钙磷浓度并不算很低,但是其影响被维D的缺乏所放大。维D、钙、磷这三种养分中任一种的不足都会放大这种不足所带来的对骨骼或机体生长发育的影响。在上述的跟进试验中,母猪机体维D的状态也对观察到的各种异常反应起到了一定的作用。
 

  母体遗留效应
 

  已有研究报道母猪日粮中的维D含量对后代仔猪的影响。有人设计实验,一组后备母猪补充325 IU D3/kg,一组不补充,对其所产后代仔猪,专门设计产房仔猪日粮(未补充维D,含120%需要量的磷)进行饲喂,两组的后代仔猪骨密度(BMD)都出现下降,比例近20%。但是,若在母猪怀孕阶段补充1750 IU D3/kg,对仔猪饲喂相同的产房仔猪日粮,未观察到BMD下降。
 

  在这个试验中,仔猪出生和断奶时并未监测到BMD的变化,此时在仔猪肾脏和肠道观察到与维D代谢相关的基因mRNA表达异常,为该阶段母体遗留效应的表现。母猪供应超量的维D会增加断奶猪体内24,25-羟化酶(CYP24A1)mRNA的表达,促进机体降解维D。
 

  这个实验以及更早的实验所验证的母猪日粮效应,可以解释SRTC在短时间内的营养缺乏可引起了如此大的影响。同时,最新的维D推荐需要量也说明SRTC所使用的维D补充量是不够的。
 

  总结,所有这些实验的结果都说明了母猪维生素D的缺乏可引起后代在胎儿阶段的骨骼异常。在初生和断奶期仅能从微观的分子水平观察到这一异常,在断奶后钙磷的缺乏会加剧这一异常而表现出显著的外观症状表现。因此,对不同阶段猪进行分子水平的检测和外观表现的观察,对于阐明猪维D相关驼背病例的发病过程,具有重要意义。中国养猪网技术站


驼背-软骨骨化损伤
 

  在驼背猪的脊柱观察到遗留的软骨组织,这证明椎体生长板发生了异常,这与软骨病所致畸形类似。在活体动物身上未发现其他宏观异常,但在对生长板表现异常的猪的股骨样本分析中,观察到生长板宽度异常(图3)。因此,有必要进一步研究参与软骨骨化过程的分子信号的变化,尤其是在胎儿和初生阶段容易被维D缺乏所改变的分子信号。
 



图3 股骨末端的生长板不规律的过宽。一个是饲喂用+D饲料的9周龄猪(+D),一个是没有补充维D的5周龄猪(-D)(没有公布结果)

 

  骨和椎骨均通过软骨骨化形成,正常情况下钙化软骨与钙化骨结合,若钙化骨结合则引起异常,包括生长板宽度异常和软骨过量残留。胞外基质(ECM)的构型和重构是软骨骨化的限速环节,此外还需要特定蛋白和信号的参与,包括基质金素蛋白酶家族(MMP),尤其是明胶酶MMP9、胶原酶MMP13和血管内皮生长因子(VEGF)。这三个标志酶直接或间接由维D介导。但在猪,还未有这些信号的表达与维D状态之间有着直接联系的证据。
 

  对猪和其他生产动物跛行的研究,主要关注对后期损伤的阐述,而忽略损伤前期的形成过程。维D相关驼背猪的模型可以诱发自发性损伤,为研究参与生长板畸形前期形成的细胞信号提供了一种方法。准确地阐述初生猪在脊柱骨和股骨畸形发展过程中的被破化的靶细胞动力学结构和细胞信号,将对特异并有效预防骨畸形具有重要的意义。
 

  继续对驼背猪进行研究,有利于我们找到需要去测量的关键因子。在过去,猪跛行多被归结于矿物元素因素或骨软骨病。对于驼背猪的一系列实验表明,驼背和骨软骨病之间可能存在信号通路。
 

  营养成分影响软骨骨化的关键信号
 

  骨的生物标记
 

  研究者做过很多利用生物标记来测定骨完整性的尝试,但最好的结果也只能定性,并且对骨骼损伤的诊断帮助甚小。即使诸如钙、磷甚至25-OH维D等是骨骼沉积矿物质的关键营养因子,但考虑到体内代谢平衡,它们对于评估骨骼完整性的价值很小。更好的掌握营养因素介导的影响骨骼的细胞信号,主要包括FGF-23、RANKL/OPG、CY27B1、CYP24A1、VEGF和MMP,对猪跛行问题的快速诊断具有重大意义。
 

  如前所述,FGF-23参与维D和磷的平衡过程。FGF-23由成骨细胞和骨细胞产生,受维D和磷的调节。活性维D促进骨组织内FGF-23的合成,分泌至全身上调肾脏Na-P转运蛋白活性,促进磷的重吸收入胞内,从而降低血磷。FGF-23抑制1α-羟化酶,同时降低维D的活性(图1b)。鉴于维D受体(VDR)在软骨组织中的表达,维D对骨组织合成FGF-23可能有直接的作用。对小鼠的软骨细胞做特异性VDR敲除后,维D通过软骨细胞介导的信号通路促进FGF-23的释放,但对于软骨细胞释放的信号因子并未阐述。最新的研究发现,补充维D的哺乳仔猪骨组织内FGF-23 mRNA的表达增高,尤其是那些被饲喂过量磷的猪。研究表明,FGF-23在磷平衡中的角色相当于骨组织的内分泌机能单位,除此之外,仅表现为钙磷的蓄积位点。
 

  FGF-23的过量释放可以抑制维D的活性,即使日粮中补充足够的维D,仍会引起维D的大量缺乏,这种反应与日粮磷过量时相似。通常猪的日粮中不会含过量的磷,但是植酸酶的摄入和使用使猪可以利用植物中的磷,从而摄入过量磷。过量FGF23的合成可以降低磷的使用效率,从而增加磷的排放,引起地表水污染。
 

  据了解,FGF23基因的表达在猪体内已经被成功检测到。运用qPCR方法,发现骨组织的FGF23 mRNA的表达受摄入的营养物质影响,但是具有相当大的多样性,对此还需要做大量的工作。我们有信心可以运用qPCR方法成功检测猪机体组织中RANKL、CYP27B1和CYP24A1 mRNA的表达,对于VEGF和MMP还未做类似尝试。
 

  成骨细胞和成熟骨细胞是参与骨形成的两种主要细胞,破骨细胞参与骨组织的再吸收,骨形成和再吸收过程在骨重构中同时存在,成年动物二者保持动态平衡。在生长期,骨形成超过重吸收,因而骨组织矿物质沉积。这些细胞不含有系统激素的受体。近期的研究发现,某些区域内的信号和细胞可以产生诱导降低破骨细胞数量并抑制其重吸收活性的信号。成骨细胞家族的细胞可接受系统激素的刺激释放信号。
 

  成骨细胞和软骨细胞均含有VDR,这说明了1,25-维D可以直接作用于骨的形成。特异无VDR的小鼠供给补充性食物,观察到骨骼矿化作用的重形成,同时观察到生长板的畸形,这说明维D直接参与了骨的形成。在增生肥厚的软骨细胞中,1,25-OH-D降低了某种蛋白的合成,该蛋白可促进FGF23的释放,并促进RANKL和VEGF的合成。RANKL和VEGF作用于破骨细胞,提高其活性和再生能力,以重吸收肥厚增生区域,从而维持正常的软骨组织结构。软骨骨化保证了骨骼的生长和正常的生长板宽度,若此过程受扰,则导致受损部位的软骨残留,以及损伤的扩展如软骨病。
 

  骨与免疫系统的联系
 

  猪群中的跛行案例常常与猪群健康状况发生混淆。而根据我们到目前为止的研究,跛行猪只未表现较大的健康问题。没有研究表明其对骨损伤与机体免疫机能之间有直接联系。破骨细胞和巨噬细胞均由机体造血干细胞分化而成,并对各种相同的细胞通路作出反映。维D在免疫应答所扮演的角色也不确定。1,25-OH-D常用于一些自身免疫病的治疗,如风湿性关节炎、I型糖尿病和脑脊髓多样性硬化。
 

  结论
 

  涉及到跛行的临床问题常常牵涉到营养配方问题,尤其是日粮中钙磷的含量,以及维D的含量。通过大量或超量补充营养成分以缓解跛行发生率的尝试往往并不能解决问题,反而可能加剧问题。营养成分尤其是钙磷的过量补充并不能保证猪能从短期的营养缺乏中恢复过来。而对于所缺乏营养成分的诊断,需要标准化的采样及分析流程。DXA技术的应用有助于准确快捷地对样本BMC作出检测,但是局限于单一的骨头,并只能准确提供骨无机质的含量。
 

  更深入地了解控制软骨骨化的细胞信号,将有助于我们了解改变和损伤发生的机制。维D缺乏引起的驼背猪模型也提供了研究生长板畸形早期形成过程的方法。



       作者信息:TD Crenshaw, L Rortvedt-Amundson,威斯康辛大学麦迪逊分销动物科技学院


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